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　　精准前沿丨Cas9+纳米孔mNGS预测下呼吸道感染危重患者的抗菌素耐药性

　　该研究评估了mNGS在细菌型LRTI中AMR预测性能，并对AMR流行病学监测和基于Cas9富集及纳米孔测序的快速耐药基因检测进行了验证。

　　本期《精准前沿》栏目分享美国旧金山Chan Zuckerberg生物中心Charles R. Langelier研究团队发表于Genome Med（IF = 15.2）上的一篇最新研究[1]，该研究通过Cas9+纳米孔mNGS对下呼吸道感染危重患者的抗菌素耐药性进行了预测和性能评估。

　　背景：抗菌素耐药性（AMR）正以惊人速度增长，使得包括下呼吸道感染（LRTI）在内的传染病治理复杂化。宏基因组下一代测序（mNGS）是一种新型的独立于培养的LRTI诊断方法，但其预测AMR的效用仍不清楚。该研究旨在评估mNGS在细菌型LRTI中AMR预测性能，并对基于Cas9富集和纳米孔测序的AMR流行病学监测和快速基因检测进行验证。

　　方法：该研究的入组人群为88名急性呼吸衰竭患者，来自先前2013年7月至2018年9月之间开展的LRTI观察性研究。纳入标准包括：年龄≥18岁，需要机械通气，并在插管后72小时内采集呼吸道标本。排除标准包括：参与度下降，LRTI诊断不明确，呼吸道样本没有匹配的RNA和DNA mNGS数据。LRTI患者由临床诊断确定。mNGS样本采自下呼吸道。首先评估了在LRTI患者中mNGS对AMR的预测性能，这些患者都有明确菌培致病菌及临床抗菌素敏感性试验（AST）结果（27个患者，32个致病菌）。其次验证了医院暴露与呼吸道微生物组中AMR基因负荷间的关联（n=88），以及采用Cas9靶向富集和纳米孔测序检测AMR基因（n=10）。

　　结果：与临床药敏试验相比，呼吸系统mNGS预测AMR的性能因病原体、抗菌药和测序核酸类型而异。对于革兰氏阳性菌，RNA+DNA mNGS组合达到了70%的敏感性（95% CI: 47-87%）和95% (95% CI: 85-99%)的特异性。对于革兰氏阴性菌，敏感性为100% (95% CI: 87–100%)，特异性为64% (95% CI: 48–78%)。与社区发病LRTI (p=0.00030)或没有LRTI的患者(p=0.0024)相比，医院发病LRTI患者的呼吸道微生物组中AMR基因负荷更大。研究还发现Cas9靶向测序可以将低丰度AMR基因富集超过2500倍，并能够通过纳米孔平台对其快速检测。

　　抗菌素耐药性（AMR）对人类健康构成明显威胁，导致下呼吸道感染（LRTI）患者治疗失败率增加，是传染病相关死亡的首要原因。对LRTI患者实施有效靶向治疗不仅需要广泛病原体的准确检测，还需要评估其耐药性。在许多情况下，AMR的评估是不现实的，因为在抗菌素敏感性测试 (AST) 之前需要从通过培养分离致病菌，这一过程可能需要数天时间，而且在先前使用抗生素的情形下产出较低。在没有明确病原诊断的情况下，LRTI治疗只能是经验性的，从而导致广谱抗生素滥用以及耐药病原体人工选择。

　　宏基因组下一代测序（mNGS）有望通过同时进行不依赖培养的病原体检测和宿主感染后基因表达谱分析来克服传统呼吸道感染诊断的局限性。原则上，mNGS也可通过检测细菌耐药基因来预测AMR。虽然菌培分离物全基因组测序性能已广泛报道，直接由呼吸道样本mNGS预测AMR的性能研究仍有限。

　　这部分是由于呼吸道等临床体液样本中病原体AMR基因丰度较低，对使用传统 mNGS方法进行检测提出了挑战。最近研究报道可采用FLASH（基于杂交检测低丰度序列）进行CRISPR/Cas9靶向富集来提高临床样本中低丰度AMR基因检测的潜力，从而克服该挑战。然而，还需要在临床队列中对FLASH方法进行独立验证。

　　为弥补上述不足，该研究在一组LRTI危重患者中评估联合使用DNA和RNA mNGS预测致病菌AMR、促进AMR流行病学监测，以及使用CRISPR/Cas9靶向富集和实时纳米孔测序来快速检测临床相关耐药基因的潜力。

　　研究人群为2013年7月至2018年9月期间入住加州大学旧金山分校（UCSF）医学中心的机械通气患者，包括70名LRTI患者和18名非感染性呼吸道疾病患者（图1）。LRTI诊断由两名医师在不依据mNGS结果前提下进行，参照美国疾病控制中心/国家医疗保健安全网络 (CDC/NHSN) 监测病例定义、已明确呼吸道病原体参考清单和回顾性电子医疗记录。纳入标准包括：年龄≥18岁、需要机械通气以及在插管后72小时内收集下呼吸道标本（气管抽吸物 (TA) 或微型支气管肺泡灌洗液 (mBAL)）。排除标准包括：患者拒绝参与、LRTI诊断不明确或无匹配RNA和DNA mNGS数据。

　　前期分析共27例患者，后期分析包括所有患者。前期分析集中在细菌性LRTI患者，这些患者有培养鉴定病原体和相应临床药敏试验结果（共27例患者，32种病原体）。其中，18例患者呼吸道样本在之前mNGS研究中进行了测序。后期分析还包括另外43 LRTI患者和18名非LRTI患者。在后期呼吸道微生物的医院暴露和AMR基因负荷分析中，共计70例LRTI患者和18例非LRTI患者。Cas9靶向富集的Illumina和纳米孔测序样本共10例，来自前期分析中由培养鉴定的LRTI患者，用于对AMR基因快速检测进行评估。

　　呼吸道微生物检测采用ID-Seq流程，包括：STAR比对去除人类基因组 (NCBI GRC h38)，PRICESeqfilter过滤低质量，以及过滤其它非微生物序列。分别采用 GSNAP-L和RAPSEARCH2检索NCBI核苷酸库（NT）和非冗余蛋白质库（NR）来鉴定剩余微生物序列。RNA-seq和DNA-seq序列比对结果向上递归到属水平，每个属水平序列再基于物种相对丰度分配到种水平。最近开发的基于规则模型 (RBM) 可用于区分疑似病原体和共生微生物。

　　RBM原理基于前期研究成果：LRTI患者微生物群落典型特征是一种或多种主要病原体丰度显著增高。具体而言，RBM按丰度值（比对到物种上的序列数）在微生物属水平降序排列，定位任何两个连续分类群间最大丰度间隔，进而确定与其余肺部微生物群相比丰度不成比例增高的属。

　　对位于最大丰度间隔之上的所有属进一步评估，在种水平上鉴定每个属中丰度最高物种。如果该物种存在于现有呼吸道病原体参考目录（源自大型流行病学监测研究），RBM会将其判定为疑似病原体。RBM原理及临床验证已在先前发表的研究中详细描述。

　　RNA-seq和DNA-seq数据中的AMR基因检测采用SRST2和扩展版ARG-ANNOT数据库，用于分析的基因变异位点覆盖率≥5%。由于肺炎链球菌是细菌性LRTI的首要病原，研究还使用了CARD抗性基因识别工具（“loose”参数设置）来筛查与链球菌β内酰胺抗性相关的pbp基因点突变。对每个样本每个变异位点，计算经基因长度和总序列数标准化后的平均序列深度，即每百万条序列深度（dpM）。

　　作为参考标准，研究者采用了每位患者入院期间在UCSF临床微生物学实验室进行的临床AST结果。为了计算不同微生物不同药物组合的敏感度和特异度，研究者对基于mNGS的耐药性预测结果和基于临床及实验室标准研究所最小抑制浓度值的表型AST结果进行比较。对有培养证实致病菌的受试者样本进行了AST。排除一例只有β内酰胺酶染色结果和二例各有≥4种菌培结果但临床意义不明的样本。在前期分析包括27名患者和32种细菌病原体。

　　该队列中检测到的复杂呼吸道感染致病菌包括：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、肠杆菌科、铜绿假单胞菌和嗜麦芽糖链球菌。针对上述致病菌，研究者评估了最常见抗生素的敏感性。AMR基因初始分类标识采用ARG-ANNOT的本体库，包括：β内酰胺、氨基糖苷类、大环内酯类/林可酰胺/链霉素、糖肽、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。更精细的AMR表型标识基于CARD的耐药组的本体关系。除敏感度和特异度外，还评估了非常重大错误率（VME：预测敏感但表型耐药）和重大错误率（ME：预测耐药但表型敏感）。

　　对于金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肠杆菌科细菌，采用临床微生物实验室常规测试的抗生素进行耐药性测试。金黄色葡萄球菌：青霉素、甲氧西林、克林霉素或红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑 (TMP/SMZ) 和万古霉素；肺炎链球菌：青霉素、头孢曲松和万古霉素；粪肠球菌：氨苄青霉素和万古霉素；肠杆菌科：氨苄西林+舒巴坦、头孢唑啉、头孢曲松、庆大霉素、哌拉西林唑巴坦、TMP-SMX、厄他培南和美罗培南；铜绿假单胞菌：氨苄青霉素+舒巴坦、头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林-他唑巴坦和美罗培南；S. maltophila：头孢他啶和TMP/SMZ。对于个别分离株，临床实验室未对某些抗生素进行临床药敏试验，因此无法进行相关统计。

　　用于AMR基因检测的FLASH Cas9靶向Illumina mNGS方法如最初报道的研究所述。简言之，先用FLASHit软件靶向设计CARD和ResFinder数据库中临床相关AMR基因的向导RNA，合并完全重复序列。用于Cas9靶向富集的向导RNA共计2226个，针对381个β内酰胺和111个MLS抗性基因，以及FLASH最初研究的127个不同AMR基因。向导RNA靶向每个AMR基因多个位点，共代表2226个目标序列。按照文献所述方法合成、合并、转录和纯化用于产生每个AMR基因靶向序列的CRISPR RNA的DNA 模板。

　　使用rAPid碱性磷酸酶对10 ng DNA进行5去磷酸化，随后用原钒酸钠失活。将去磷酸化DNA添加到含有CRISPR/Cas9核糖白复合物的预混液中，并在 37 °C 下孵育2小时。Cas9用蛋白酶K灭活，并用SPRI珠纯化去除。参照先前描述的详细方法，按NEBNext Ultra II文库制备试剂盒（New England Biolabs，Ipswich，MA）操作流程，对样品进行加尾，然后进行Illumina测序。首先使用ARG-ANNOT检测AMR基因，对检测到dpM 0.的基因再与单独使用DNA-seq相比，进行富集评估。

　　对FLASH富集的DNA文库定量，并加入200-800 ng DNA制备Nanopore 1D文库（操作文档：SQK-LSK109，牛津纳米孔，英国）。各个样本库加载到 GridION仪器的单个流槽中，在MINKNOW中以实时模式读取序列碱基。参照之前报道，运行-a模式下的SURPIrt流程，在每100,000 - 200,000序条列中检测AMR基因。

　　为尽量减少环境污染导致不准确的物种分类，研究者在每组样本中添加经过核酸提取流程的阴性水对照，而且在每轮上机中添加阳性对照临床样本。在所有样本中，RNA-seq和DNA-seq分析得到的物种每百万原始序列数（rpm）值均减去水对照中比对到相应物种的值。由于将所有样本的宏基因组文库PCR扩增到固定标准浓度会导致水对照中污染源的选择性扩增偏倚，在做减法之前，研究者参考先前研究，水对照中物种rpm值先采用所有样本中该物种的中位数值进行矫正。为解决AMR基因检测中的环境污染，水对照中深度 1的耐药位点会被过滤掉。

　　主要产出是mNGS预测表型AST的性能。次要产出包括医院暴露与呼吸道菌群AMR基因负荷之间的关系，以及基于Cas9靶向富集和纳米孔测序的AMR基因检测。

　　统计显著性定义为双端假设检验P0.05。非参连续性变量采用威尔逊秩和检验进行分析。

　　根据纳入和排除标准确定了70例LRTI患者和18非LRTI患者。前期分析包括27例受试者，后期分析包括所有受试者。采样后出具临床AST结果的中位数为74小时（95% CI：49 - 115小时）。前期分析中，27例受试者均为培养证实的细菌性LRTI患者，共检出32种致病菌，各进行了不少于2种抗生素的临床AST。后期分析中，43例受试者为LRTI患者，18例受试者为非LRTI患者。

　　呼吸道样本中，呼吸道样本中，DNA-seq总序列数均值为4.3×10 7 （四分位间距：1.9-4.4×10 7 ），RNA-seq总序列数均值为6.9×10 7 （四分位间距：4.8-8.3×10 7 ）。在前期AMR分析中，研究者使用先前验证的宏基因组RBM来鉴定呼吸道致病菌，这些致病菌与其余肺部微生物相比呈现不成比例高丰度。32个培养证实的致病菌中，RBM共检出26个（81 %）。四个漏检致病菌存在于多种微生物共培养中，另一个漏检致病菌被确定为不同的链球菌物种。RNA-seq和DNA-seq分别鉴定了138个和234个获得性AMR基因。AMR基因分类中，β内酰胺耐药基因最常见（81/372，35%）。

　　研究者评估了mNGS预测临床指南推荐使用抗生素的耐药性能，包括用于革兰阴性感染的8种药物和用于革兰阳性感染的6种药物。基于CARD数据库中耐药组本体注释识别的部分AMR基因与培养证实致病菌无关，在后续分析中被剔除。与基于培养的 AST 参考标准相比，mNGS预测AST的敏感性和特异性因病原体、药物、患者和测序核酸类型而异。对于革兰阳性致病菌，DNA-seq和RNA-seq组合分析的灵敏度为70% (CI 47–87%)，特异度为95% (CI 85–99%)，准确度为87% (CI 78–94%）。这相当于30% 的 VME 率和 5% 的 ME 率。对于革兰阴性致病菌，DNA-seq和RNA-seq组合分析的灵敏度为100% (CI 87–100%) ，特异度为64% (CI 48–78%)，准确度为78% (CI 67–87%）。这相当于VME率为0%，ME率为36%。

　　在基因型到表型假阳性 (ME) 预测的7例受试者中，有2例患者的mNGS鉴定出与菌培结果无关但与在几天后与通气相关肺炎（VAP）的AMR基因。其中患者（213）的SST-1预测位点与4天后出现的粘质沙雷氏菌VAP相关，患者（232）的mecA预测位点与7天后出现的金黄色葡萄球菌VAP相关。

　　DNA和RNA mNGS对下呼吸道耐药组的评估提示了LRTI阳性和阴性患者中AMR基因的多样性。AMR基因负荷不因LRTI患病状态而异（p=0.28）。与社区发病LRTI (p=0.00030)或非LRTI (p=0.0024) 患者相比，医院发病（入院后48小时）LRTI 患者在其呼吸道微生物组中AMR基因负荷更大。

　　在前期分析的10例患者中，研究者验证了最近报道的FLASH方法的实用性。该方法基于CRISPR/Cas9可编辑原理来富集低丰度AMR基因。FLASH+DNA mNGS文库制备方案在NEBNext DNA-seq标准3小时工作流程中增加了2.5小时，与单独 DNA-seq相比，可将培养证实致病菌AMR基因的检测富集 2500×。在四例患者中，FLASH能够检测到与培养证实致病菌和耐药表型相关的AMR基因，但单独进行DNA-seq会漏诊，包括两例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌LRTI患者中的mecA位点。FLASH还在五名患者中检测到与菌培结果无关的AMR基因。

　　之后，研究者还评估了使用FLASH与牛津纳米孔测序平台进行快速AMR基因检测的潜力，该平台可提供实时生成测序数据。Illumina鉴定的所有AMR基因（测序深度中位数：1.20×108[四分位数间距：5.41×107–1.36×108]）也可通过FLASH及纳米孔测序鉴定（测序深度中位数：1.19×106 [四分位数间距：1.02×106–1.46×106]）。AMR基因目标区域可在实时纳米孔测序10分钟内被识别，提示单个样本潜在周转时间不到6小时。

　　抗菌素耐药性已成为人类健康面临的最紧迫问题之一，复杂感染的有效治疗越来越需要对微生物耐药性进行早期和准确评估。该研究在先前呼吸系统mNGS研究基础上证实RNA和DNA mNGS可以不依赖菌培结果对细菌性LRTI危重患者AMR进行预测，而且对不同细菌和抗菌素的预测性能各异。虽然未观察到对革兰阴性菌的假阴性敏感性预测，但革兰阳性菌的VME为30%，表明mNGS具有补充而不是替代目前基于精细培养的标准方法。

　　先前已有报道证实mNGS在培养阴性LRTI病例中的应用，这些培养阴性病例占所有肺炎病例一半以上。该研究表明mNGS也可预测培养阴性LRTI患者的AST，其中AMR基因可提示治疗隐匿性耐药菌。此外，该研究还支持最近相关报道，即mNGS有助于早期识别未来继发性呼吸道感染。例如，因严重肺炎克雷伯菌LRTI入院的患者232在接受氨曲南（一种未覆盖MRSA的抗菌素）治疗后，在8天患上了MRSA呼吸机相关性肺炎(VAP)。而在VAP发病前7天获得的TA标本mNGS分析已检测到mecA基因，为之后发现的AMR VAP致病菌提供了早期线索。

　　公共卫生监测对于防范大流行、预测AMR趋势和防止耐药生物体爆发至关重要。该研究证明了mNGS用于AMR流行病学监测的可行性，并提示医院暴露与下呼吸道微生物组中AMR基因负荷间的关联。重点关注的是，该研究还包括培养阴性LRTI病例，补充了先前文献报道的关于菌培阳性肺炎病例中存在类似的关联。

　　纳米孔测序已被报道可从呼吸道样本中检测高丰度病原体。但序列碱基准确度和检测灵敏度的挑战长期限制了其检测稀有序列的潜力。靶向富集可通过增强AMR信号来克服该问题。与之一致，该研究发现经过FLASH Cas9靶向富集，纳米孔和Illumina平台对AMR基因的检测结果高度一致。研究结果还表明，Cas9靶向富集和纳米孔mNGS的有机结合可增强呼吸系统致病菌的AMR基因检测和耐药性预测。

　　鉴于合理使用抗菌药的时间与死亡率相关，快速检测AMR基因对于细菌感染危重症患者至关重要。FLASH在DNA文库制备标准工作流上增加了2.5个小时，与实时检测AMR基因的mNGS平台相结合，可在6小时内出结果。与≥24小时的Illumina平台相比更节省时间。在该研究队列中，临床AST平均耗时74小时，这表明靶向Cas9的纳米孔测序可能是一种有前途的更快检测感染患者耐药基因的新方法。此外，研究还发现 FLASH富集了与菌培结果无关的可能来自肺微生物的AMR基因。对检测的ARM基因进行物种特异性注释有望解决上述问题，否则可能会由于假阳性结果而导致ME增加。

　　该研究优势包括：是评估LRTI中mNGS AMR预测性能的最大研究，并且基于参考标准系统地评估了多种抗菌药性能；首次在无菌培结果的条件下对呼吸系统医疗暴露和耐药基因负担进行了评估，首次提供了Cas9靶向富集结合纳米孔快速检测AMR的新范例。该研究也有一些局限性，包括：样本量、抗菌药谱、致病菌谱以及对结果的独立验证。未来在一个更大的、更多致病菌和耐药机制的前瞻性队列中进行深入研究可以弥补这些限制。另外，还需要随机临床试验来评估mNGS对及时合理的抗菌治疗、抗菌药管理和LRTI结果的潜在影响。最后，AMR基因型对表型的预测仍然不完善，即使对于培养的分离株也是如此。与AMR的其他分子检测方式一样，这一点在评估mNGS用于AMR表型预测的效用和临床适用性时应考虑在内。

　　总之，该研究评估了mNGS在细菌型LRTI中AMR预测性能，并对AMR流行病学监测和基于Cas9富集及纳米孔测序的快速耐药基因检测进行了验证。END